La loi de 1905 proclame en premier lieu la liberté de conscience : "La République assure la liberté de conscience". Elle a pour corollaire la liberté religieuse, la liberté d’exercice du culte et la non-discrimination entre les religions.

Elle pose en second lieu le principe de la séparation des Églises et de l’État : "La République ne reconnaît, ne salarie ni ne subventionne aucun culte". Elle met fin au Concordat instauré en 1802 qui régissait les relations entre l’État et les cultes. Jusqu'alors, l’État reconnaissait quatre cultes (catholique, réformé, luthérien, israélite) qui étaient organisés en service public du culte. L’État payait les ministres du culte et participait à leur désignation ainsi qu’à la détermination des circonscriptions religieuses. Les autres cultes n’étaient pas reconnus.

L’État se veut désormais neutre. Il n’y a plus de religion légalement consacrée. Tous les cultes sont traités de manière égale.

Le régime de séparation a plusieurs conséquences, prévues par la loi :

• le budget des cultes est supprimé, à l’exception de ceux relatifs aux aumôneries des lycées, des hospices, des prisons, etc. Les aumôneries sont autorisées pour permettre le libre exercice des cultes dans les lieux publics fermés ;
• les établissements publics du culte, jusque-là chargés de la gestion des cultes, sont remplacés par des associations cultuelles, créées par loi. Ces associations doivent avoir pour unique objet l’exercice d’un culte. Elles ne peuvent pas recevoir de subventions publiques. Leurs ressources doivent provenir de l’argent des cotisations d’adhésion, des quêtes et des collectes pour l’exercice du culte. L’Église catholique refuse toutefois de constituer ces associations, qui ne reconnaissent pas l’autorité de l’évêque. En 1923, un compromis est trouvé et des associations diocésaines, placées sous la présidence des évêques, sont constituées ;
• les règles concernant le régime de propriété des édifices cultuels sont redéfinies. Restent propriétés de l’État, des départements ou des communes, les édifices religieux qu’ils possédaient avant la loi (notamment ceux nationalisés en 1789). Les édifices religieux qui appartiennent aux établissements publics du culte sont, pour leur part, attribués aux associations cultuelles. Toutefois, devant le refus de l’Église catholique de créer de telles associations, une loi de 1907 prévoit que tous les édifices catholiques deviennent propriété publique. Ils sont mis à la disposition des fidèles et des ministres du culte. Quant aux édifices postérieurs à la loi de 1905, ils sont la propriété des associations cultuelles ou diocésaines qui les ont construits.

La loi met en place un certain nombre de règles permettant d'encadrer les manifestations religieuses dans l'espace public : 

• elle proscrit la tenue de réunions politiques dans les locaux cultuels ;
• les cérémonies et manifestations religieuses à l'extérieur sont soumises à déclaration préalable (la déclaration se fait auprès du maire ou du préfet à Paris) ;
• la loi interdit également "d’élever ou d’apposer aucun signe ou emblème religieux sur les monuments publics ou en quelque emplacement public que ce soit", sauf dans les cimetières et les musées.

Désormais, l'État a pour rôle de veiller à ce que les pratiques religieuses ne troublent pas l'ordre public. application relèvent du ministère de l'intérieur, et les peines sont prononcées par des juges. La loi du 24 août 2021 dite "loi séparatisme" réforme la loi de 1905 dans le sens d'un renforcement des sanctions en cas de violation à la police des cultes.