En tant que chambre de la cour d'appel, la chambre de l’instruction est la juridiction d'instruction du second degré. Elle possède donc une fonction juridictionnelle en seconde instance.

Avant la loi du 15 juin 2000 sur la présomption d'innocence, cette chambre s'appelait "chambre d'accusation". 

Les appels auxquels cette chambre répond sont essentiellement adressés contre les décisions des juges d'instruction et des juges des libertés et de la détention (JLD). 

Par ailleurs, la chambre de l'instruction a ses propres fonctions d'instruction. Elle peut : 

• infirmer une ordonnance ;
• signaler le dépassement des délais légaux par le juge d'instruction ;
• rouvrir une information judiciaire, même si celle-ci a été clôturée par un non-lieu, dès lors que des charges nouvelles apparaissent.

La chambre de l'instruction est composée :

• d'un président désigné par décret après avis du Conseil supérieur de la magistrature ;
• de deux conseillers désignés pour un an par l'assemblée générale de la cour d'appel ;
• d'un représentant du ministère public (qui est le procureur général ou un de ses avocats généraux) ;
• d'un greffier issu de la cour d'appel. 

La chambre de l’instruction est chargée de garantir la bonne marche de la justice pénale, à travers des contrôles qu’elle exerce sur ses différents acteurs :

• elle veille au bon déroulement de l’instruction : elle règle les conflits de compétence entre juges et s'assure du bon fonctionnement des cabinets d’instruction (respect de la procédure et des délais) ;
• elle exerce un contrôle sur l’activité des fonctionnaires investis de fonctions dans la police judiciaire : elle peut leur adresser des observations ou les suspendre de leurs activités judiciaires ;
• la chambre de l’instruction intervient en matière d’extradition, de réhabilitation et d’interprétation de l’application des lois d’amnistie.